一、原理：

 

用酸處理過的活性炭把還原型的抗壞血酸氧化為脫氫型抗壞血酸再繼續(xù)氧化為二酮古樂糖酸。二酮古樂糖酸與2.4-二硝基苯肼偶聯(lián)生成紅色的絡(luò)合物。其呈色的強(qiáng)度與二酮古樂糖酸濃度成正比，可以比色定量。

二、試劑：

（1） 1％草酸溶液。

（2） 2％草酸溶液。

（3）

酸處理過的活性炭：取200克活性炭，加入10％鹽酸1000ml，煮沸后，抽氣過濾，再用沸水1000ml煮沸，過濾，重復(fù)用水洗至濾液中無高價(jià)鐵離子（即用1％硫溶液試驗(yàn)不呈紅色為止），于100-120℃烘干。

（4）

2％2.4-二硝基苯肼溶液：取2克2.4-二硝基苯肼溶液溶解于lOOml9N硫酸中。

（5）

9N硫酸溶液：量取濃硫酸250ml，慢慢地倒入750m1水中，加水邊攪拌。

（6）

10％硫酸溶液：稱取5克硫酸，溶解于50ml50％酒精中。

（7）

85％硫酸溶液：精確稱取20mg抗壞血酸，溶解在1％草酸中，溶液稀釋至lOOml。吸取此液50ml，加入0.1克活性炭，振搖1分鐘，過濾吸取上述濾液5ml，用1％草酸稀釋到100毫升（此標(biāo)準(zhǔn)使用液每亳升含lOug抗壞血酸）。

三、操作方法：

（1）樣品的處理和分析：稱取適量樣品加等量的2％草酸溶液于組織搗碎機(jī)中打成勻漿。取勻漿20克用1％草酸稀釋至lOOml，搖勻，過濾。

取濾液lOml，加入1％草酸10ml（取濾液的量視抗壞血酸含量而定，一般控制每毫升抗壞血酸的濃度為1-lOug），加l勺活性炭，搖1分鐘，靜置過濾。

各取濾液2毫升于樣品管和樣品空白管中，各管加1滴硫酸溶液。于樣品管中加入2.4-二硝基苯肼0.5ml，樣品管，樣品空白管加蓋，置于37℃保溫箱中保溫3小時。后取出樣品管放人冰水中，樣品管和樣品空白管置于冰浴中，從滴點(diǎn)管中滴加85％硫酸2ml于各管中，邊滴邊搖試管（為防止溶液溫度升高，溶液中糖炭化而轉(zhuǎn)黑色）。

將各管于冰浴中取出，在室溫下放置30分鐘后，立即在分光光度計(jì)波長540nm處讀取光密度。根據(jù)測得的光密度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相應(yīng)的含量。

（2）

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別吸取抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)工作液10、20、30、40、50ml，稀釋至50ml，這些標(biāo)準(zhǔn)液每毫升含有2、4、6、8、lOug抗壞血酸。   

各取2ml，置于各標(biāo)準(zhǔn)管中，加硫酸溶液1滴和2．4-二硝基苯肼溶液0.5ml，置各管于30℃保溫箱中保溫3—4小時，取出，放在冰浴中，于各管中滴加85％硫酸2.5ml邊滴邊搖試管，然后取出，放置30分鐘，于分光光度計(jì)540nm波長條件下測定光密度。根據(jù)測得的光密度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

同時作一試劑空白，于一試劑空白管中加入1％草酸溶液2m1，操作同標(biāo)準(zhǔn)管。

計(jì)算：每百克食品中含抗壞血酸的毫克數(shù)＝C/W×100

C：相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)溶液的量（mg）

W：測定時所取得樣品溶液相當(dāng)于樣品的量（g）

四、說明：

（1）    加入85％硫酸后，將試管從水中取出。溶液的顏色會繼續(xù)變深所以必須計(jì)算好，加入硫酸后準(zhǔn)于30分鐘內(nèi)比色。

（2）硫酸可防止抗壞血酸被氧化，且可幫助準(zhǔn)于的形成，*終溶液中硫酸的濃度均需一致，否則影響色度。